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发布时间:2022-09-08 01:17:00 作者:远大弘元
武汉远大弘元股份有限公司以氨基酸及其衍生物的研发、生产为基础,以武汉大学生命科学学院和湖北省氨基酸工程技术研究中心的成果为依托,为客户提供的产品。
天津工业生物技术研究所研究员刘君带领的微生物生理和代谢工程研究组和研究员江会锋带领的新酶设计与酵母基因组工程研究组进行合作,通过结合代谢工程和蛋白质工程的方法,系统地改造大肠杆0菌,实现了OAH的合成。在研究中,首先比较了两种不同来源的高丝氨酸乙酰转移酶(MetX),然后通过敲除竞争和消耗途径基因(metA,metB和thrB)并过表达合成途径基因(thrA,metxlm),实现了OAH的积累,其产量达到1.68 g/L。为了进一步提高OAH的生产,该研究采用多种代谢工程策略对工程菌株进行进一步改造,包括:敲除赖氨酸竞争途径基因lysA;在王恩多的指导下,博士研究生范佳奕等人纯化了ScoLeuRS和I类ScotRNALeu(CAA)与II类ScotRNALeu等受体的代表ScotRNALeu(UAA)。利用启动子工程调控ppc表达以增强草酰乙0酸的供给;比较不同来源的天冬氨酸激酶,促进前体天冬氨酸的合成等,使OAH的产量提高至4.69 g/L。然而,中间代谢产物高丝氨酸的大量积累说明其下游途径关键酶MetXlm的催化能力是不足的。为了解决这一问题,该研究分别采用基于进化保守性和基于结构信息的蛋白质工程策略对MetXlm进行改造,获得的突变体酶活比型提高了12.15倍并受到更少的反馈抑制。通过优化表达MetXlm突变体,使工程菌株OAH产量达到7.37 g/L。随后该研究通过过表达胞内乙酰CoA合成途径,调控胞内NADPH的合成,进一步提高OAH的合成能力。终获得的工程菌株OAH-7在7.5 L发酵罐中经60 h发酵能够生产62.7 g/L的OAH,是目前报道的0高水平。
化学合成半胱氨酸需多步反应,产生DL-型外消旋体,只有经过化学拆分才能得到所需要的L-半胱氨酸,用于L-半胱氨酸中间体的合成。
L-半胱氨酸的发酵法生产现在正处于尝试探索阶段,大规模的生产还受到一定条件的限制,其主要原因是因为微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂,而且合成中的关键问题是一SH的来源
胱硫醚循环酶法不能够消除内生β-胱硫醚,而恰恰有很多人,尤其是疾病患者的内生β-胱硫醚水平非常高(可高达>300μmol/L,大部份< 20μmol/L)。因此间接法的Hcy试剂受到了内生胱硫醚的明显干扰。另外,间接法试剂易受脂肪酶、铁试剂干扰。间接法优点就是价格便宜。随后该研究通过过表达胞内乙酰CoA合成途径,调控胞内NADPH的合成,进一步提高OAH的合成能力。
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